哺乳动物蛋白提取试剂盒的组成包括：5X Buffer 10ml、5X NaCl 10ml、5X SDS 10ml、5X DOC 10ml、5X NP-40 10ml，以及20X PBS 10ml和Protease inhibitor cocktail 0.5ml。该试剂盒可在常温保存，但Protease inhibitor cocktail需在-20°C条件下保存，库龄可达24个月。

提取步骤

1. 准备细胞裂解缓冲液

根据5X Buffer、5X NaCl、5X SDS、5X DOC和5X NP-40比例1:1:1:1:1 (v/v) 配制细胞裂解缓冲液。每1ml细胞裂解缓冲液适用于提取106~107个细胞或5~20mg组织的蛋白。使用前，请添加10μl的Protease inhibitor cocktail以保护目标蛋白活性。

2. 洗涤细胞或组织

a) 对于贴壁细胞：去除细胞生长培养基，用PBS缓冲液清洗细胞两次。添加细胞裂解缓冲液使其浓度达到106~107个细胞/ml，接着将细胞完全浸入冰袋中，并在摇床上孵育30分钟。此时，可阶段性地将细胞在细胞裂解缓冲液中重悬，一旦结束，刮取并收集裂解液。
b) 对于悬浮细胞：将细胞以700xg离心5分钟，弃掉上清液。随后用PBS重悬细胞洗涤两次，在4°C下离心并去除上清液。将沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中（106~107个细胞/ml），放置于冰袋中，在摇床上孵育30分钟。
c) 对于组织：将组织切割成小块，使用PBS清洗两次。加入细胞裂解缓冲液（5~20mg组织/ml），并将样本（包含细胞裂解缓冲液）转移到预冷微量匀浆器中，在冰上均匀化组织30~50次。请注意，均质化过程对于目标蛋白的活性至关重要。在34°C下，以12,000xg离心10分钟以沉淀细胞碎片，或采用100,000xg高速离心45分钟进行蛋白提取。

3. 保存提取的蛋白质

将含有蛋白质的上清液移至冷冻管中，在冰上保存即可立即使用，或将蛋白质溶液存放于-70°C以备后续使用。使用ag尊龙凯时品牌的试剂盒，能够确保提取的蛋白质高效且稳定，最大程度保留其生物活性。