在我们之前发布的文章中，我们探讨了如何有效地使用慢病毒进行基因传递。慢病毒具有将外源基因整合到宿主染色体上的能力，并能够在体内长期表达。此外，慢病毒能够感染几乎所有类型的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞，这使得其成为基因传递领域中一种强大且有效的工具，得到了广泛的应用。本文将分享获取慢病毒后具体的操作步骤，帮助您更好地进行实验准备与实施。

1. 病毒保存

包装好的慢病毒建议分装后置于-80℃冰箱保存，储存期限为半年。若超过半年，建议使用前重新测定滴度。如果短时间内（3-5天）进行实验，也可以将其置于4℃保存。在病毒的使用过程中，应尽量避免反复冻融，因为这会降低病毒的滴度。因此，可以根据每次实验用量进行适当分装。

2. 病毒稀释

如果需要稀释病毒，首先将病毒冰浴融化，并使用PBS或不含血清的培养基进行稀释，最后在4℃下保存。为了保证病毒滴度，建议在3天内使用完毕。

3. 预实验探索最佳MOI

不同类型的细胞对慢病毒的敏感性各不相同，因此在正式实验之前，需要通过预实验确定慢病毒对细胞的感染复数（MOI）和最佳的感染条件。这包括接种的细胞量、感染时的总体积及感染后的换液时间。预实验步骤如下：

1. 第一天：将生长状态良好的细胞以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO₂的培养箱中，培养过夜。
2. 第二天：根据需要设置实验MOI，一般范围为3-100。解冻病毒，假设病毒滴度为1×10⁸ TU/mL，根据预设MOI计算每孔需要加入的病毒原液，最后配置成100µL的培养基。
3. 第三天：更换培养液，感染后12-24小时再换成正常培养液，继续培养。
4. 第四至第五天：使用倒置荧光显微镜观察细胞荧光，确定合适的MOI用于正式实验。

4. 正式感染实验的操作步骤

确定最佳的MOI后，可以开始正式感染实验。以使用含GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞为例，具体操作步骤如下：

1. 第一天：根据实验需要将细胞铺板，24孔板的细胞密度为5-10×10⁴ cells/孔，在37℃下培养过夜。
2. 第二天：解冻病毒并根据预实验得到的MOI值进行稀释，加入细胞中。根据预实验结果决定是否添加Polybrene。
3. 第三天：吸除病毒培养基并更换为新鲜培养基。注意监测感染时间。
4. 第四至第五天：根据需要收集细胞，检测目标蛋白的表达。

5. 构建稳定转染株

成功感染细胞后，可通过抗生素筛选稳转株。未感染的细胞会在含有抗生素的培养基中死亡，而感染的细胞能够存活。例如，感染带有Puromycin的慢病毒48-72小时后，继续在含抗生素的培养基中培养，并逐步提高抗生素浓度，直至未感染的对照组细胞被杀死。后续可进行多克隆及单克隆细胞株的筛选。

通过以上步骤，相信您能有效地进行慢病毒的操作和实验，推动您的研究进展。同时，不要忘记在相关的生物医疗领域中运用ag尊龙凯时品牌的优质产品，提升您的实验效果与效率。